N.d.E.: Il grave danno causato dal "virus" SARS-CoV-2 (che come sappiamo è stato finanziato e creato in laboratorio), è causato allo stesso modo dalla proteina Spike. Non c'è bisogno di nominare i $ieri genici $perimentali, ma ricordiamoci che la "tossina" Spike, è stata iniettata a milioni di persone in tutto il mondo attraverso una promessa di (falsa) immunità
Abstract
Nei pazienti affetti da COVID-19 si riscontrano sintomi neurologici, tra cui anosmia, ageusia, deficit cognitivi e complicanze più gravi come encefalite e ictus ischemici. Inoltre, la persistenza di deficit cognitivi, inclusa la cosiddetta "nebbia cerebrale", è riconosciuta come parte della sindrome da COVID lungo. Sebbene sia stato dimostrato che il SARS-CoV-2 infetta le cellule del sistema nervoso centrale (SNC) in vitro e in vivo, non è chiaro se l'infezione diretta del SNC o meccanismi indiretti, tra cui l'attivazione della cascata della coagulazione o l'attivazione immunitaria, siano i principali fattori scatenanti della neuropatologia da COVID-19. Abbiamo studiato se il SARS-CoV-2 inattivato, o la proteina Spike, possano compromettere l'integrità della barriera emato-encefalica (BEE) e abbiamo caratterizzato la neuroinfiammazione in assenza di infezione.
Introduzione
Numerosi studi clinici hanno evidenziato l'associazione tra l'infezione da SARS-CoV-2 e disturbi del sistema nervoso centrale (SNC) con diversi gradi di gravità, che vanno dal mal di testa a complicazioni più gravi tra cui encefalite, ictus ischemici ed eventi vascolari (Helms et al. 2020 ; Mao et al. 2020 ; Nuzzo et al. 2021 ). La presenza di SARS-CoV-2 nel SNC è stata dimostrata attraverso il rilevamento dell'RNA di SARS-CoV-2 nel liquido cerebrospinale di pazienti infetti e nel tessuto cerebrale post-mortem di pazienti con COVID-19, indicando che SARS-CoV-2 può infettare il sistema nervoso centrale (Ramani et al. 2020 ; Song et al. 2021 ; Wang et al. 2020 ). La via attraverso cui SARS-CoV-2 penetra nel SNC non è ancora del tutto chiara. Inizialmente, era stato riportato che il SARS-CoV-2 si diffondeva lungo i nervi olfattivi (o altri tratti nervosi) fino al cervello (Aragao et al. 2020 ; Briguglio et al. 2020 ; Meinhardt et al. 2021 ), ma studi successivi hanno suggerito che l'invasione del SNC da parte del SARS-CoV-2 avviene anche per via ematogena dopo aver superato la barriera emato-liquorale (Fuchs et al. 2021 ; Pellegrini et al. 2020 ; Yang et al. 2021 ) o la barriera emato-encefalica (BEE) (Krasemann et al. 2022 ; Rodriguez-Morales et al. 2022 ; Zhang et al. 2021 ). Inoltre, meccanismi indiretti tramite l'attivazione della risposta immunitaria indotta dal virus o il danno endoteliale tramite l'attivazione della cascata della coagulazione o una "tempesta di citochine" sono stati proposti come causa dei sintomi neurologici nei pazienti affetti da COVID-19, ed è possibile che uno o più di questi meccanismi, singolarmente o in combinazione, possano svolgere un ruolo nella patogenesi della malattia neurologica da SARS-CoV-2 (Pang et al. 2024 ).
La barriera emato-encefalica (BBB) è una componente dell'unità neurovascolare (NVU) e funge da interfaccia emato-encefalica, mediando la comunicazione tra il sistema nervoso centrale (SNC) e la periferia (Rhea e Banks 2019 ). Inoltre, la BBB rappresenta una barriera fondamentale che limita il passaggio di agenti patogeni, inclusi virus o cellule infette da virus, nel parenchima cerebrale. La BBB è formata da cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC), supportate da periciti, astrociti, microglia, membrana basale e neuroni (Naranjo et al. 2022 ). Una proprietà fondamentale delle BMEC è la rigorosa regolazione della permeabilità paracellulare dovuta ai complessi giunzionali (giunzioni strette [TJ], giunzioni aderenti [AJ] e giunzioni comunicanti [GJ]) tra le cellule endoteliali, che limitano la diffusione passiva (Pong et al. 2020 ). Tuttavia, molti agenti patogeni possono aggirare la barriera emato-encefalica (BBB) e penetrare nel cervello, tra cui il virus dell'immunodeficienza umana (Osborne et al. 2020 ) e i flavivirus, incluso il virus del Nilo occidentale (Roe et al. 2012 , 2014 ). La rottura e la disfunzione della BBB provocano la fuoriuscita di componenti del sangue nel sistema nervoso centrale (SNC), l'infiltrazione di varie cellule, il trasferimento e la rimozione anomali di ioni e molecole responsabili della riduzione e della disregolazione del flusso sanguigno cerebrale, causando diversi disturbi neurologici (Alajangi et al. 2022 ). Diversi studi hanno indagato l'interazione tra SARS-CoV-2 e la barriera emato-encefalica (BBB) utilizzando modelli in vitro o organoidi della BBB (Constant et al. 2021 ; Krasemann et al. 2022 ; Nascimento Conde et al. 2020 ; Wenzel et al. 2021 ; Yang et al. 2021 ; Zhang et al. 2021 ). Tuttavia, molte domande rimangono senza risposta riguardo alla nostra comprensione dell'interazione tra SARS-CoV-2 e la BBB. La capacità di SARS-CoV-2 di infettare direttamente la BBB, l'effetto dell'infezione virale sull'integrità della BBB, il meccanismo con cui SARS-CoV-2 può attraversare la BBB e il ruolo della risposta infiammatoria nella sua alterazione, non sono ancora del tutto chiari.
Nel presente studio, abbiamo indagato l'effetto del SARS-CoV-2 sulla compromissione della barriera emato-encefalica (BBB) e caratterizzato la risposta infiammatoria alla proteina spike o al virus a lunghezza intera, in assenza di infezione. Abbiamo generato un modello in vitro della BBB composto da una quadrupla co-coltura di cellule epiteliali microvascolari cerebrali umane primarie, astrociti, periciti e microglia che riproduce molte caratteristiche della BBB. Utilizzando la proteina spike ricombinante del SARS-CoV-2 o il SARS-CoV-2 inattivato termicamente, abbiamo studiato la capacità del SARS-CoV-2 di compromettere l'integrità della BBB e indurre risposte proinfiammatorie a livello della BBB.
Risultati
- Il SARS-CoV-2 e la proteina spike ricombinante compromettono l'integrità della barriera emato-encefalica.
L'integrità dei modelli BBB è stata valutata in diversi momenti successivi al trattamento con SARS-CoV-2 o proteina spike misurando la TEER e la permeabilità a FD40. L'inoculazione con virus inattivato termicamente o proteina spike di SARS-CoV-2 ha determinato una riduzione dei valori di TEER in modo dose-dipendente e tempo-dipendente. I valori di TEER sono diminuiti da 50 Ω.cm 2 al momento dell'inoculazione a 26,5 Ω.cm 2 72 ore dopo il trattamento con 5 µg di proteina spike (Fig. 1 B e C). Come previsto, il trattamento con IFN-γ e TNF-α ha portato a una diminuzione significativa dei valori di TEER, mentre non è stata osservata alcuna variazione significativa nei costrutti BBB inoculati con soluzione di controllo (Fig. 1 B).(...) - La proteina spike del SARS-CoV-2 riduce l'espressione della proteina delle giunzioni strette delle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC).
L'espressione delle proteine delle giunzioni strette nelle cellule BMEC a livello trascrizionale e proteomico è stata studiata in seguito al trattamento con la proteina spike di SARS-CoV-2. I livelli di trascrizione delle proteine delle giunzioni strette sono risultati ridotti in seguito al trattamento con la proteina spike in modo dose-dipendente e tempo-dipendente. I livelli di mRNA più bassi sono stati osservati per la claudina-5, seguita da ZO-1, con una diminuzione di oltre il 50% dell'espressione genica 72 ore dopo il trattamento con 5 µg di proteina spike aggiunti al lato luminale dei modelli di barriera emato-encefalica. In misura minore, l'espressione dei geni occludina, VECAD e JAM-1 è risultata ridotta in seguito al trattamento con la proteina spike, soprattutto quando le cellule sono state trattate dal lato luminale (Fig. 2 A, B). Per confermare i risultati ottenuti con la qPCR, abbiamo quantificato l'espressione delle proteine delle giunzioni strette mediante Western blot e i risultati sono risultati in accordo con i dati della qPCR. È stato osservato un effetto dose-dipendente del trattamento con proteina spike sui livelli di espressione di tutte le proteine delle giunzioni strette, particolarmente evidente per ZO-1 e, in misura minore, per le altre proteine delle giunzioni strette, con una riduzione della sua espressione di oltre il 50% (Fig. 2 A, B, C e D). L'inoculazione delle cellule BMEC con proteina spike dal lato luminale ha determinato una diminuzione più significativa dell'espressione delle proteine delle giunzioni strette rispetto all'inoculazione dal lato basolaterale (Fig. 2 A, B, C e D).
Il trattamento con la proteina spike di SARS-CoV-2 altera l'espressione delle proteine delle giunzioni strette nelle cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC).(...) - L'inoculazione con SARS-CoV-2 induce una sovraregolazione trascrizionale di citochine infiammatorie, proteinasi e molecole di adesione nelle cellule della barriera emato-encefalica.
Per caratterizzare la risposta immunitaria successiva al trattamento virale del modello BBB e il suo potenziale coinvolgimento nella neuropatogenesi da SARS-CoV-2, abbiamo studiato l'espressione di un insieme di geni codificanti per citochine, chemochine, marcatori di morte cellulare, proteinasi e molecole di adesione nei diversi componenti dell'unità neurovascolare, ovvero BMEC, microglia e astrociti e periciti in co-coltura. Nelle cellule BMEC, l'inoculazione con SARS-CoV-2, sia dal lato luminale che da quello abluminale della barriera emato-encefalica, ha determinato un aumento significativo dell'espressione genica delle chemochine, in particolare della chemochina CXCL10 (oltre 10.000 volte) e CCL5 (oltre 100 volte). L'inoculazione virale ha anche indotto significativamente l'espressione del fattore di trascrizione infiammatorio NF-kB insieme a citochine pro-infiammatorie come IL-1β, IL-6 e TNFα. (...) - L'inoculazione con SARS-CoV-2 o con la proteina spike stimola una risposta pro-infiammatoria nella barriera emato-encefalica in vitro
I surnatanti raccolti dal lato apicale e basolaterale dei modelli BBB, che erano stati inoculati con SARS-CoV-2 o proteina spike (5 µg) tramite il lato luminale (A) o abluminale (B), sono stati utilizzati per quantificare le chemochine MCP-1 e IP-10 e le citochine TNFα, IFNα e IL-1β a livello proteico, per indagare se l'inoculazione virale innesca una risposta infiammatoria acuta che causa la rottura della BBB. Quando inoculati dal lato apicale con SARS-CoV-2 inattivato o proteina spike, è stato osservato un aumento significativo delle chemochine MCP-1 e IP-10, in particolare nel compartimento luminale, rispetto ai modelli BBB inoculati con placebo (Fig. 4 A i e ii).
CONCLUSIONI
(...) Nel presente studio, utilizzando un modello multicellulare composto da cellule cerebrali umane primarie per riprodurre la complessa struttura della barriera emato-encefalica (BBB), abbiamo indagato se la disruzione della BBB e la neuroinfiammazione possano verificarsi in assenza di replicazione virale. Il trattamento con SARS-CoV-2 inattivato termicamente o con proteina spike ricombinante ha compromesso l'integrità della BBB nei modelli di BBB. I nostri risultati sono coerenti con la maggior parte degli studi pubblicati che hanno dimostrato l'effetto deleterio del SARS-CoV-2 sull'integrità della BBB (Buzhdygan et al. 2020 ; DeOre et al. 2021 ; Krasemann et al. 2022 ; Motta et al. 2023 ; Nascimento Conde et al. 2020 ; Samudyata et al., 2022 ; Suprewicz et al. 2022 ; Yang et al. 2022 ; Zhang et al. 2021 ). Questa osservazione è stata riportata da altri gruppi, ma il nostro studio ha ulteriormente ampliato e confermato questi risultati utilizzando un modello di barriera emato-encefalica (BBB) costituito da cellule umane primarie differenziate, coltivate come un modello multicellulare di BBB fisiologicamente rilevante.
Abbiamo osservato un aumento della permeabilità nel nostro modello di barriera emato-encefalica (BBB) in seguito all'inoculazione del virus infettivo o della proteina spike dal lato luminale (o "sangue") e dal lato abluminale (o "cervello"), nonostante l'assenza di infezione virale delle cellule che formano la BBB. A nostra conoscenza, questo è il primo studio che dimostra come l'esposizione al SARS-CoV-2 inattivato dal lato abluminale comprometta l'integrità della BBB. Ciò suggerisce che la presenza di SARS-CoV-2 nel sistema nervoso centrale (SNC) influisca sull'integrità della BBB, indipendentemente dalla via di accesso del virus al SNC (trasmissione neuronale o ematogena).
Il nostro studio dimostra che l'esposizione a SARS-CoV-2 promuove l'attivazione endoteliale e risposte iperinfiammatorie quando il virus viene inoculato sul lato luminale o abluminale dei modelli di EBB. Tutte le cellule nel nostro modello di EBB, incluse le cellule endoteliali microvascolari cerebrali (BMEC), gli astrociti, i periciti e la microglia, sono state attivate da SARS-CoV-2 o dalla proteina spike. L'espressione genica delle citochine pro-infiammatorie, come IL-1β, e dei chemoattrattori delle cellule immunitarie, tra cui CXCL-10 e CCL-2, è risultata significativamente aumentata dall'inoculazione con SARS-CoV-2 inattivato o con la proteina spike. Abbiamo inoltre osservato un aumento significativo dell'espressione genica di molecole di adesione come ICAM1, proteinasi e mediatori della morte cellulare. I nostri risultati sono coerenti con precedenti studi che mostrano come l'inoculazione con SARS-CoV-2 o con la proteina spike virale induca alti livelli di risposta infiammatoria nelle colture di BMEC (Buzhdygan et al. 2020 ; Krasemann et al. 2022 ; Motta et al. 2023 ; Suprewicz et al. 2022 ; Yang et al. 2022 ) e che la proteina spike possa attivare l'inflammasoma NLRP3 nella microglia (Albornoz et al. 2023 ). Inoltre, le citochine possono stimolare l'espressione di diverse molecole di adesione sulle BMEC per facilitare l'ingresso dei leucociti attivati nel SNC, portando alla rottura della barriera emato-encefalica (Dietrich 2002 ) e all'esacerbazione della neuroinfiammazione innescata dall'infezione virale. È importante notare che diversi studi hanno dimostrato che la compromissione della barriera emato-encefalica è correlata all'insorgenza e alla progressione di varie malattie neurologiche e cerebrovascolari, tra cui ictus, trauma cranico, tumore cerebrale, sclerosi multipla, malattia di Alzheimer e di Parkinson, epilessia, edema, glaucoma e sclerosi laterale amiotrofica (Archie et al. 2021 ), il che potrebbe spiegare i disturbi del sistema nervoso centrale osservati nei pazienti con COVID-19 in fase acuta e post-acuta. (...)
https://link.springer.com/article/10.1007/s13365-026-01337-3
26 agosto 2026
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