Effetti cancerogeni dell'esposizione a lungo termine dal periodo prenatale al glifosato e agli erbicidi a base di glifosato nei ratti Sprague-Dawley

Abstract
Gli erbicidi a base di glifosato (GBH) sono gli agenti diserbanti più utilizzati al mondo. Le preoccupazioni per la salute pubblica sono aumentate da quando l'Agenzia Internazionale per la Ricerca sul Cancro (IARC) ha classificato il glifosato come probabile cancerogeno per l'uomo nel 2015. Per approfondire gli effetti del glifosato e dei GBH sulla salute, l'Istituto Ramazzini ha avviato lo Studio Globale sul Glifosato (GGS), progettato per testare un'ampia gamma di esiti tossicologici. Qui riportiamo i risultati della parte dello studio dedicata alla cancerogenicità.

Metodo
Il glifosato e due GBH, Roundup Bioflow utilizzato nell'Unione Europea (UE) e RangerPro utilizzato negli Stati Uniti, sono stati somministrati a ratti Sprague-Dawley (SD) maschi e femmine, a partire dal sesto giorno di gestazione (tramite esposizione materna) fino all'età di 104 settimane. Il glifosato è stato somministrato attraverso l'acqua potabile in tre dosi: la dose giornaliera ammissibile (ADI) dell'UE di 0,5 mg/kg di peso corporeo/giorno, 5 mg/kg di peso corporeo/giorno e il livello senza effetti avversi osservati (NOAEL) dell'UE di 50 mg/kg di peso corporeo/giorno. Le due formulazioni GBH sono state somministrate alle stesse dosi equivalenti di glifosato.

Risultati
In tutti e 3 i gruppi di trattamento, rispetto ai controlli storici e contemporanei, sono state osservate tendenze statisticamente significative correlate alla dose o un aumento dell'incidenza di tumori benigni e maligni in più siti anatomici. Questi tumori sono insorti nei tessuti emolinforeticolari (leucemia), nella cute, nel fegato, nella tiroide, nel sistema nervoso, nelle ovaie, nella ghiandola mammaria, nelle ghiandole surrenali, nei reni, nella vescica urinaria, nelle ossa, nel pancreas endocrino, nell'utero e nella milza (emangiosarcoma). L'aumento dell'incidenza si è verificato in entrambi i sessi. La maggior parte di questi tumori era rara nei ratti SD (incidenza di base <1%) e il 40% dei decessi per leucemia nei gruppi trattati si è verificato prima delle 52 settimane di età; è stato osservato un aumento dei decessi precoci anche per altri tumori solidi.

Discussione

Il risultato principale di questo studio biennale sulla cancerogenicità a lungo termine del glifosato e di due formulazioni commerciali di GBH è stato un aumento dell'incidenza (statisticamente significativo, correlato alla dose e/o superiore rispetto ai controlli storici NTP e RI) di tumori benigni e maligni multipli nei ratti SD a livelli di esposizione corrispondenti alla DGA del glifosato dell'UE e al NOAEL dell'UE (Tabella 19).

In tutti e tre i gruppi di trattamento è stato osservato un aumento correlato alla dose dell'incidenza di leucemia e di tumori della pelle, del fegato, della tiroide e del sistema nervoso rispetto al controllo concomitante o ai controlli storici, indicando che il glifosato era sufficiente a determinare gli effetti cancerogeni osservati in tutti i gruppi. È stato osservato un aumento statisticamente significativo dell'incidenza di tumori mammari nei maschi nei gruppi trattati con glifosato e Roundup Bioflow, mentre sono stati registrati casi sporadici nelle tre dosi esposte a RangerPro, analogamente ai tumori ovarici, dove sono stati osservati aumenti solo nel glifosato e nel Roundup Bioflow, indicando che il glifosato era probabilmente responsabile degli effetti cancerogeni osservati in tutti i gruppi. I tumori delle ghiandole surrenali hanno registrato un aumento dell'incidenza solo con l'esposizione ai GBH (Roundup Bioflow e RangerPro), suggerendo che queste formulazioni potrebbero aver potenziato gli effetti cancerogeni del glifosato o avere un meccanismo d'azione comune diverso da quello correlato al glifosato. I tumori del rene, della vescica urinaria, l'emangiosarcoma e il pancreas endocrino sono aumentati solo con il trattamento con GBH (Roundup Bioflow o RangerPro), suggerendo che meccanismi d'azione diversi da quelli correlati al glifosato potrebbero essere responsabili di questi aumenti (Tabella 19).

In relazione alla leucemia, i due risultati chiave del nostro studio sono stati, in primo luogo, una significativa tendenza correlata alla dose nell'aumento dell'incidenza della leucemia e, in secondo luogo, l'insorgenza precoce della leucemia nei ratti esposti. Tendenze correlate alla dose nell'incidenza della leucemia sono state osservate sia nei maschi che nelle femmine, mentre la maggior parte dei risultati significativi è stata osservata nei maschi. Quando maschi e femmine sono stati considerati insieme, la significatività statistica è diventata costantemente più forte. Nessun caso di leucemia è stato osservato negli animali di controllo non trattati.

Per quanto riguarda i decessi per leucemia nei gruppi trattati con glifosato e GBH, il 40% si è verificato prima del primo anno di età (52 settimane), che è paragonabile a meno di 35-40 anni di età negli esseri umani [41]. Al contrario, negli ultimi dieci anni, su oltre 1600 ratti SD non trattati studiati dall'NTP e dal RI, non sono stati osservati casi di morte per leucemia prima dell'età di un anno (Fig. 4). L'insorgenza precoce della leucemia osservata nei gruppi trattati con glifosato e GBH sembra essere dose-dipendente ed è probabilmente dovuta all'esposizione prenatale, poiché il trattamento è iniziato durante la gravidanza.

Il glifosato e i GBH hanno indotto un aumento dell'incidenza di tumori cutanei sia nei maschi che nelle femmine. Nessun caso di tumori cutanei (maligni o benigni) è stato osservato negli animali di controllo. Portier [42] ha riferito che vi sono “prove evidenti che la somministrazione orale di glifosato nei ratti SD maschi provoca tumori cutanei (tumore basocellulare e cheratoacantoma)”. Anche i risultati ottenuti da George et al. [43] suggeriscono che il glifosato ha un potenziale cancerogeno per la pelle nei topi Swiss maschi. È importante notare che, nei lavoratori agricoli e negli applicatori di pesticidi, il contatto con la pelle è una via di esposizione importante [6, 44]. Questi risultati sono coerenti con quelli di due studi caso-controllo, condotti in aree geografiche diverse (Italia e Brasile), che mostrano un rischio elevato di melanoma cutaneo in relazione all'esposizione ai pesticidi e in particolare agli erbicidi (glifosato) e ai fungicidi (mancozeb, maneb) [45].

Il carcinoma epatocellulare è una lesione rara nei ratti SD. Nel presente studio, il glifosato e i GBH hanno indotto un aumento dell'incidenza di carcinoma epatocellulare rispetto ai controlli storici. Sebbene non sia stata raggiunta una significatività statistica dell'incidenza rispetto ai controlli concomitanti, in molti gruppi trattati è stato osservato più di un caso di carcinoma epatocellulare a dosi diverse. Inoltre, anche se nel presente studio non è stato possibile osservare una chiara relazione dose-risposta, ciò potrebbe essere influenzato dalla durata dell'esperimento (104 settimane), poiché il carcinoma epatocellulare si verifica principalmente in animali molto anziani (età media alla morte 118 settimane nel controllo storico RI). Va notato che l'adenoma epatocellulare è già stato considerato correlato all'esposizione al glifosato nei ratti SD maschi [42], probabilmente a causa delle dosi più elevate testate [46]. Il glifosato e i GBH sembrano indurre stress ossidativo nel fegato in diversi ceppi di ratti, anche a dosi relativamente basse [47,48,49]. Lo stress ossidativo è una modalità d'azione riconosciuta per la genotossicità e la cancerogenicità nel fegato, anche se forse con una soglia [50]. Un'indagine condotta su lavoratori agricoli nell'ambito dello studio statunitense Agricultural Health Study ha mostrato una correlazione positiva tra i livelli di glifosato nelle urine e i marcatori di stress ossidativo, che includevano livelli elevati di 8-idrossi-2'-deossiguanosina [51]. Il glifosato può contribuire allo sviluppo di disturbi epatici e sindrome metabolica tra i giovani. Nell'ambito dello studio CHAMACOS, Ezkenazi et al. hanno riportato questa associazione osservando che un aumento dell'acido amminometilfosfonico (AMPA) nelle urine durante l'infanzia era correlato a un aumento del rischio di transaminasi epatiche elevate (14%) e sindrome metabolica (55%); inoltre, vivere in prossimità di applicazioni agricole di glifosato durante la prima infanzia (dalla nascita ai 5 anni) era associato alla sindrome metabolica all'età di 18 anni [52]. Inoltre, l'esposizione ai GBH è stata associata a danni al DNA nel fegato in uno studio sugli animali. Il profilo molecolare del fegato nei ratti esposti al GBH Roundup Bioflow o al glifosato puro per 90 giorni ha rivelato che solo le formulazioni aumentavano la steatosi epatica e la necrosi e che sia il glifosato che le formulazioni alteravano l'espressione genica, compresa l'attivazione del TP53 [47]. Inoltre, il profilo dei piccoli RNA nel fegato ha mostrato alterazioni nei profili dei miRNA sia con l'esposizione al glifosato che al Roundup Bioflow e anche che l'esposizione al solo glifosato ha provocato danni al DNA, come dimostrato dalla formazione di siti apurinici/apirimidinici [47]. Inoltre, è stato osservato un aumento della concentrazione dei biomarcatori dello stress ossidativo, collegati al danno al DNA e alla potenza degli interferenti endocrini, in proporzione alla concentrazione di glifosato rilevata nel sangue e nel plasma seminale [53].

La ghiandola mammaria del ratto maschio è un bersaglio sensibile per valutare gli effetti delle sostanze chimiche che alterano il sistema endocrino (EDC), considerando anche la recente aumento dell'incidenza del cancro al seno maschile [54]. L'Organizzazione per la cooperazione e lo sviluppo economico (OCSE) considera la valutazione della ghiandola mammaria del ratto maschio come un endpoint correlato alle EDC nelle sue linee guida per i test di tossicità orale subcronica [55]. Essendo un tessuto ormono-dipendente, la crescita e la differenziazione della ghiandola mammaria sono associate all'azione delle vie degli estrogeni e di altri assi ormonali [54, 55]. Nei ratti SD, analogamente agli esseri umani, i tumori mammari maschili sono molto meno frequenti rispetto alle femmine [56]. Pertanto, la presenza di diversi tumori della ghiandola mammaria nei ratti maschi nel nostro studio è interessante considerando che il periodo di esposizione includeva la programmazione prenatale e l'aumento dell'incidenza osservato per una serie di altri tumori correlati al sistema endocrino nei gruppi trattati con glifosato e GBH (cioè tumori dell'ovaio, della tiroide e della ghiandola surrenale). In particolare, sono stati osservati 3 adenocarcinomi delle ghiandole mammarie nei maschi trattati con RangerPro, 2 casi nel gruppo con la dose più bassa (3,92%) e 1 caso nel gruppo con la dose più alta (1,96%) (Materiali supplementari: Tabella 1). 

Sebbene nell'attuale studio non sia stata raggiunta la significatività statistica, l'incidenza dell'adenocarcinoma mammario nei maschi è superiore a quella riportata dall'NTP (1/590, 0,17%) [30] e dai controlli storici RI (14/3572, 0,39%). In uno studio condotto da Gomez et al. [57], l'esposizione al GBH durante la gravidanza e l'allattamento ha interferito con lo sviluppo delle ghiandole mammarie nei ratti maschi, interrompendo la regolazione delle reti di espressione genica; non si può escludere che una regolazione genica compromessa possa portare in età avanzata a una maggiore suscettibilità allo sviluppo di tumori dopo la pubertà e la maturità sessuale.

Come riportato nell'INHAND [23], i tumori mesenchimali maligni renali sono rari e sono stati dimostrati essere indotti nei ratti solo da potenti sostanze chimiche genotossiche [47]. Sebbene possano verificarsi sporadicamente, ad esempio, nella revisione biennale sulla cancerogenicità pubblicata dall'NTP nel 2007, non è stata trovata alcuna registrazione di questo tipo di tumore nel gruppo di controllo dei ratti di nessuno studio dell'NTP. Nella maggior parte degli studi, il tumore mesenchimale renale è presente come tumore singolo in un gruppo a dose singola [58], come riportiamo qui per i ratti maschi esposti alla dose più alta di Roundup Bioflow. Altri studi sul cancro nei roditori hanno riportato tumori renali dovuti all'esposizione al glifosato [42, 58]. Il lavoro agricolo e l'uso professionale di pesticidi sono stati associati ad un aumento del rischio di carcinoma renale, con un rischio elevato tra i consumatori più assidui di diversi pesticidi, compresi i GBH [59].

Frazier et al. [23] hanno anche riferito che i carcinomi spontanei del tratto urinario inferiore e della pelvi renale sono tumori rari nella maggior parte delle specie e dei ceppi di roditori. I carcinomi transizionali spontanei nella vescica urinaria o nell'uretra dei topi sono rari e solo poche sostanze chimiche genotossiche li hanno indotti sperimentalmente. Chandra et al. [60] hanno riferito che solo 1 ratto SD maschio e 1 femmina presentavano carcinoma a cellule transizionali su 2669 ratti (1340 maschi e 1329 femmine) provenienti da 17 studi di carcinogenicità. Nei controlli storici NTP [30] e RI non è stato osservato alcun caso di carcinoma a cellule transizionali del rene. Data la sua rarità nei ratti, è piuttosto difficile valutare l'importanza di questa lesione in relazione all'esposizione ai GBH. Uno studio caso-controllo, condotto su cani (Scottish Terrier), ha suggerito che l'esposizione a prati o giardini trattati con erbicidi, compresi i GBH, era associata a un aumento del rischio di carcinoma a cellule transizionali della vescica urinaria [61].

I nostri dati indicano che la tumorigenesi del glifosato può colpire i tessuti endocrini. Il carcinoma corticale surrenale è un tumore raro nei ratti SD. Una “chiara evidenza” di carcinogenicità surrenale nei ratti SD femmine è stata attribuita nella rianalisi di Portier [42], che ha valutato studi che utilizzavano livelli di esposizione al glifosato puro rispetto al presente studio. I nostri risultati mostrano la presenza di carcinoma corticale delle ghiandole surrenali nei ratti SD maschi esposti a RangerPro e Roundup Bioflow, suggerendo che i componenti GBH potrebbero aver potenziato gli effetti cancerogeni del glifosato o avere un meccanismo d'azione comune diverso da quello correlato al glifosato. In uno studio a breve termine (2 settimane) condotto solo su ratti maschi e solo con Roundup Bioflow, gli autori hanno osservato una riduzione della regolazione del recettore dell'ormone adrenocorticotropo endogeno (ACTH), una condizione simile a quella umana nota come insufficienza surrenalica [62]. 

Al contrario, Owagboriaye et al. [63] hanno osservato nei ratti maschi un aumento significativo dose-dipendente dell'aldosterone e del corticosterone sierici dopo un'esposizione prolungata (13 settimane) a un GBH, ma non dopo l'esposizione a dosi equivalenti di glifosato. Ciò suggerisce che i GBH potrebbero avere un impatto sull'asse ipotalamo-ipofisi-surrene, che potrebbe potenzialmente portare, in caso di esposizione per tutta la vita, al cancro della corteccia surrenale [42]. Sono stati osservati aumenti dei tumori alla tiroide nei ratti SD maschi e femmine, con un effetto più pronunciato nelle femmine trattate con glifosato puro. Questo risultato è in linea con la letteratura; è stato suggerito che i fattori di rischio ambientali svolgano un ruolo cruciale nell'aumento dell'incidenza delle neoplasie tiroidee nell'uomo e alcuni pesticidi sono stati riconosciuti tra questi fattori [64,65,66]. 

In un altro studio condotto su ratti SD, è stata osservata una tendenza significativamente positiva nell'incidenza dell'adenoma delle cellule C tiroidee nei ratti femmina [6, 67]; va notato che la somministrazione è iniziata all'età di 8 settimane e non in fase prenatale come nel presente studio. Portier [42] riporta anche “prove equivoche” di adenoma e carcinoma delle cellule C della tiroide in entrambi i sessi e di adenoma e carcinoma follicolare della tiroide nei ratti SD maschi trattati dall'età adulta. I nostri dati suggeriscono che lo sviluppo pre e/o postnatale può essere una finestra sensibile per il cancro alla tiroide provocato dall'esposizione al glifosato.

Gli effetti tossici del glifosato sul sistema nervoso sono stati descritti in una recente revisione sistematica, che mostra che il glifosato produce importanti alterazioni nella struttura e nella funzione del sistema nervoso di esseri umani, roditori, pesci e invertebrati [68]. Un'altra recente revisione sistematica e meta-analisi sull'esposizione dei genitori ai pesticidi, compreso il glifosato, e sui tumori cerebrali infantili ha rivelato un'associazione tra questi tumori e l'esposizione prima del parto, dopo la nascita e l'esposizione residenziale [68, 69]. Inoltre, è stato scoperto che le miscele di pesticidi, compreso il glifosato, sono associate al cancro in generale, ai tumori cerebrali e ad altri tumori del sistema nervoso centrale e alla leucemia tra i bambini, come recentemente riportato da Taiba et al. [70] e anche dall'Istituto nazionale francese per la salute e la ricerca medica (Inserm) [71]. 

Nel nostro studio, il sistema nervoso periferico e centrale è stato colpito in misura variabile da tutti e tre i tipi di trattamenti a base di glifosato ed in entrambi i sessi. Nei maschi, nel gruppo trattato con glifosato ad alto dosaggio si è verificato un tumore maligno a cellule granulari nel sistema nervoso centrale, mentre nel sistema nervoso periferico è stato osservato uno schwannoma maligno, associato in particolare al dosaggio più elevato di Roundup Bioflow. Il ruolo del glifosato e dei GBH nell'alterazione del sistema nervoso periferico e centrale necessita ancora di indagini più approfondite, in particolare quando l'esposizione ha inizio nelle prime fasi di vita o in utero. Studi recenti hanno suggerito che il glifosato e i GBH alterano lo sviluppo del cervelletto, principalmente influenzando la migrazione e la differenziazione delle cellule granulari, e che l'esposizione perinatale porta a cambiamenti a lungo termine nel sistema nervoso dei ratti maschi adulti [72, 73]. 

Nel nostro studio, è stato osservato un effetto sul sistema nervoso periferico anche nelle femmine, poiché abbiamo rilevato diversi schwannomi benigni e maligni dell'utero, in particolare nei gruppi esposti al glifosato e al RangerPro. Occasionalmente, si osservano schwannomi maligni nell'utero/cervice dei ratti, ma di solito solo in seguito all'esposizione ad agenti alchilanti ad azione diretta, come l'N-nitrosoetilurea o il metilmetansolfonato [29]. 

L'esposizione ai GBH, nelle prime fasi dello sviluppo neuronale, induce una disregolazione di varie vie di segnalazione sia nel SNC che nel SNP; in particolare, i GBH alterano l'espressione della proteina S100B, un marker di danno al sistema nervoso nei ratti Wistar, inducendo una downregulation durante lo sviluppo e una upregulation nella prole adulta dopo esposizione cronica [68]. Tutti questi risultati sulla neurotossicità del glifosato sono coerenti con le segnalazioni che indicano che l'esposizione ambientale ai pesticidi aumenta il rischio di disturbi neurodegenerativi umani come il morbo di Parkinson [74].

Nel nostro studio sulla cancerogenicità del glifosato e dei GBH, è stato osservato un aumento dell'incidenza di tumori ossei maligni e benigni con tutti e 3 i trattamenti. Solo pochi agenti (ad esempio fluoruro di sodio, ormone paratiroideo e peptidi correlati, radiazioni ionizzanti) hanno dimostrato, nei test sul cancro nei roditori, di causare osteosarcoma con prove equivoche o chiare [26, 75,76,77]. Nei ratti SD, anche dopo soli sette giorni di somministrazione di glifosato, il carico corporeo totale era concentrato principalmente nelle ossa [78]. Alterazioni della struttura ossea e cartilaginea sono state osservate in diversi modelli, tra cui il pesce zebra, in seguito all'esposizione precoce al glifosato [79]. Uno squilibrio del metabolismo osseo (calcio e fosforo) è stato osservato nei ratti in seguito a un'esposizione subcronica ai GBH [80]. Pertanto, i nostri risultati confermano che il tessuto scheletrico è un bersaglio della tossicità del glifosato e indicano che i tumori ossei possono essere un effetto apicale rilevante di una lunga esposizione.

Per valutare i nostri risultati in un contesto più ampio, osserviamo che nell'ultimo mezzo secolo l'incidenza dei tumori infantili è aumentata del 35% [81] e che le prove epidemiologiche e gli studi meccanicistici suggeriscono che l'esposizione materna ai pesticidi è associata a un aumento del rischio di leucemia infantile [70, 82], come già suggerito in precedenza anche da un gruppo di lavoro organizzato dall'Autorità europea per la sicurezza alimentare [83]. Recenti studi epidemiologici hanno ampliato le conoscenze sulla cancerogenicità umana del glifosato e dei GBH. Una recente meta-analisi riporta che i GBH sono associati a un aumento del 41% del rischio relativo di linfoma non Hodgkin tra gli individui altamente esposti [84]. Skidmore et al. [85] hanno dimostrato una significativa relazione temporale e geografica tra l'espansione della coltivazione di soia geneticamente modificata tollerante al glifosato nelle regioni brasiliane dell'Amazzonia e del Cerrado e i decessi per leucemia linfoblastica acuta nei bambini, uno dei tumori del sangue pediatrici più comuni. Hardell et al. [86] hanno pubblicato i risultati di un'analisi combinata di tre studi caso-controllo svedesi che includevano 1425 casi e 2157 controlli, esaminando l'esposizione agli acidi fenossiacetici e al glifosato in relazione al linfoma non Hodgkin e hanno dimostrato un'associazione tra il linfoma non Hodgkin e l'esposizione a questi erbicidi. 

Un altro studio incentrato sull'esposizione ai pesticidi agricoli e sul rischio di leucemia infantile in una comunità italiana ha riportato un aumento del rischio nei bambini che risiedono in prossimità di colture arabili esposte a una miscela di glifosato e altri pesticidi [82, 87]. In un rapporto di follow-up aggiornato dello United States Agricultural Health Study, un ampio studio prospettico di coorte che ha esaminato l'incidenza del cancro fino al 2012 (Carolina del Nord)/2013 (Iowa) con 7290 casi, ha mostrato prove di un aumento del rischio di leucemia mieloide acuta nel gruppo con la più alta esposizione al glifosato [59, 88]. Inoltre, in un recente studio di Taiba et al. [70] è stata osservata un'associazione positiva tra miscele di prodotti agrochimici contenenti glifosato e un aumento dei casi di leucemia giovanile (< 20 anni di età). Recentemente è stato ipotizzato che parte del glifosato assorbito possa migrare rapidamente nel midollo osseo e poi nelle ossa, dove può bioaccumularsi e contribuire al rischio di neoplasie ematopoietiche (ad esempio, leucemia) [89].

Gli studi di carcinogenicità sugli animali forniscono una plausibilità biologica a questa letteratura epidemiologica in espansione che collega i GBH al cancro, dimostrando la capacità del glifosato di causare diversi tipi di cancro e lesioni genotossiche [90]. I principali siti di neoplasie osservati in precedenza in altri studi a lungo termine sul glifosato nei ratti SD erano reni, fegato, pelle, pancreas, tiroide e testicoli nei maschi e surrenali e tiroide nelle femmine. In altri ceppi di ratti, le lesioni correlate all'esposizione al glifosato erano tumori al fegato e alla pelle, solo nei maschi, e tumori mammari e surrenali nelle femmine. L'incidenza di tumori renali era aumentata anche nei topi CD-1 maschi, insieme a tumori mesenchimali e linfomi [42]. Tutti gli studi sui ratti e sui topi erano tuttavia basati su un'esposizione che iniziava in una fase standard della vita postnatale, all'inizio dell'età adulta, e includevano dosi generalmente superiori a quelle testate nel GGS. L'unico studio a lungo termine (postnatale) condotto su ratti SD che includeva dosi simili o inferiori a quelle del GGS è stato riportato da Lankas et al. [91] (~ 3, 10, 31 mg/kg p.c./giorno), in cui l'incidenza di tumori al pancreas (dose bassa), ai testicoli (tendenza) e alla tiroide (tendenza) era significativamente aumentata [6, 42].

L'esposizione ai GBH, nelle prime fasi dello sviluppo neuronale, induce una disregolazione di varie vie di segnalazione che portano sia al SNC che al SNP [68, 72, 73, 91, 92]. Oltre al danno al DNA, la perturbazione endocrina è un meccanismo rilevante della tumorigenesi. Il glifosato e i GBH potrebbero agire come interferenti endocrini negli esseri umani e nei modelli animali, come ampiamente documentato in letteratura [9, 66, 93,94,95]. Nel GGS, il glifosato e il Roundup Bioflow hanno mostrato effetti significativi simili agli androgeni sui parametri riproduttivi [9]. Nel presente studio, gli effetti potenzialmente associati alla perturbazione endocrina includevano tumori mammari maschili, della corteccia surrenale e della tiroide. Un ulteriore possibile effetto di perturbazione endocrina del Roundup Bioflow è il caso del tumore maligno delle cellule della granulosa ovarica, un tumore raro nei ratti SD, osservato nel gruppo trattato con dosi elevate di Roundup e che causa la morte prematura a sole 43 settimane di età. L'esposizione cronica a basse dosi (fino a 2,0 mg/kg di peso corporeo) di glifosato altera il proteoma ovarico e quindi influisce sulla funzione ovarica nei topi; secondo gli autori, le vie correlate allo stress ossidativo sono l'obiettivo primario [96]. È stato scoperto che i GBH alterano la proliferazione delle cellule della granulosa in modelli in vitro, suggerendo che l'esposizione ai GBH potrebbe avere effetti più potenti del solo glifosato, in linea con i risultati del GGS [9, 96, 97]. È riportato in letteratura che l'esposizione cronica al GBH potrebbe anche alterare la funzione endocrina del pancreas e l'istologia [98]. In particolare, abbiamo osservato una tendenza significativamente aumentata nel carcinoma delle cellule insulari in RangerPro.

Le ossa sono un altro tessuto con una forte e complessa regolazione endocrina, che include gli ormoni paratiroidei, ipofisari, tiroidei e steroidei. Il nostro studio indica che le ossa sono un bersaglio della cancerogenicità del glifosato e dei GBH. Le prove raccolte su ratti Wistar femmine esposte ai GBH hanno associato lo squilibrio calcio-fosforo osservato e le alterazioni della struttura ossea a un metabolismo tiroideo compromesso [90]. È interessante notare che un recente studio epidemiologico basato sui dati NHANES ha collegato i livelli di glifosato nelle urine alla riduzione della densità minerale ossea nella popolazione statunitense affetta da malattie indotte da diversi agenti chimici [26]. Pertanto, i nostri risultati suggeriscono che le ossa potrebbero essere un ulteriore bersaglio della tumorigenesi endocrina provocata dal glifosato e dai GBH [27].

I nostri risultati sono anche coerenti con le precedenti revisioni effettuate da Portier [42] e IARC [6] sulla cancerogenicità del glifosato nei ratti SD, come mostrato nella tabella 20. In particolare, gli aumenti tumorali osservati nel nostro studio sono coerenti con precedenti studi sui ratti SD per quanto riguarda la pelle, il fegato, la tiroide, lo stroma dei cordoni sessuali-gonadici, la ghiandola surrenale, i reni e il pancreas endocrino. In particolare, nella maggior parte dei casi l'aumento dei tumori era coerente non solo in termini di organo bersaglio, ma anche in termini di sesso. Aumenti di leucemia, sistema nervoso, ossa ed emangiosarcoma sono stati osservati solo nel nostro studio. Ciò è probabilmente associato alla maggiore sensibilità del disegno dello studio: l'esposizione che copre anche lo sviluppo prenatale e prepuberale ha consentito di rilevare gli effetti cancerogeni causati da esposizioni precoci che non possono essere efficacemente esplorati se l'esposizione dell'animale inizia dall'età adulta. Nel nostro studio è stato possibile osservare anche l'insorgenza precoce e la mortalità per leucemia e una serie di altri tumori rari (fegato, ovaie e sistema nervoso) grazie alla sensibilità del disegno dello studio prenatale, poiché gli studi sugli adulti avrebbero latenze tumorali più lunghe e potrebbero non essere altrettanto sensibili, in particolare per gli effetti delle basse dosi. A partire dalle prove fornite dal Prof. Maltoni nei suoi studi di cancerogenicità sull'esposizione precoce al cloruro di vinile negli anni '70 [99], fino alla sua più recente adozione da parte del Programma tossicologico nazionale degli Stati Uniti [100], il disegno prenatale per i test sul cancro nei ratti SD è ora ampiamente considerato un modello predittivo e affidabile per l'uomo. Infatti, è stato chiaramente dimostrato che l'esposizione a sostanze chimiche, anche a basse dosi, durante le fasi prenatali e di sviluppo della vita può provocare una serie di effetti dannosi e a lungo termine, tra cui il cancro [81]. Questo concetto, denominato “origini dello sviluppo della salute e della malattia” (DOHaD), è oggi ampiamente accettato e rappresenta un pilastro delle strategie di prevenzione della salute pubblica per una serie di malattie, tra cui obesità, diabete di tipo 2, insulino-resistenza, asma, malattie cardiovascolari, disturbi comportamentali, malattie neurodegenerative, disturbi riproduttivi e cancro [101].

I nostri risultati forniscono una visione nuova e più completa della cancerogenicità del glifosato nei ratti e sono coerenti con precedenti segnalazioni di aumento dei tumori negli animali da laboratorio esposti al glifosato e ai GBH [6, 42]. Il nostro studio presenta alcuni limiti. Uno di questi è che, sebbene abbiamo confrontato il glifosato e due delle sue formulazioni più diffuse (Roundup Bioflow e RangerPro), non abbiamo potuto esaminare gli effetti sulla salute degli specifici coadiuvanti presenti nei GBH. La rilevanza tossicologica dell'aumento dell'incidenza di tumori rari è difficile da valutare, in particolare quando la significatività statistica è borderline o quando l'incidenza dei tumori risulta eccessiva solo se confrontata con i controlli storici. Nel tentativo di superare questo limite e chiarire la plausibilità biologica dell'aumento dei tumori rari, li abbiamo confrontati con le incidenze dei controlli storici RI e NTP. Inoltre, i nostri dati non forniscono informazioni dirette sui meccanismi tumorigenici e sulle modalità d'azione del glifosato; tuttavia, esaminando la letteratura disponibile, ipotizziamo che potrebbero essere coinvolti la genotossicità e la perturbazione endocrina, ma non si possono escludere altri meccanismi come la riparazione difettosa del DNA o i geni oncosoppressori. 

Infine, ci siamo concentrati sulla descrizione accurata degli effetti senza tentare di ricavare dosi di riferimento, lasciando tale approfondimento a una futura fase di caratterizzazione del rischio. Tuttavia, la DGA dell'UE è stata fissata a 0,5 mg/kg di peso corporeo al giorno, sulla base di un NOAEL di 53 mg/kg di peso corporeo al giorno derivante da uno studio di 90 giorni sui cani e supportato dal NOAEL di 59,4 mg/kg di peso corporeo al giorno derivante da uno studio di 2 anni sui ratti e che copre il NOAEL di 50 mg/kg di peso corporeo al giorno per la tossicità materna identificata in uno studio sulla tossicità dello sviluppo nei conigli [21]. È stato applicato il fattore di incertezza standard (UF) di 100. In particolare, nel presente studio abbiamo osservato effetti a dosi pari o inferiori al NOAEL nei roditori e in altri modelli animali.

Conclusioni
Il glifosato e i GBH a livelli di esposizione corrispondenti alla DGA dell'UE e al NOAEL dell'UE hanno causato aumenti correlati alla dose nell'incidenza di tumori benigni e maligni multipli nei ratti SD di entrambi i sessi. Per diversi tumori sono stati osservati insorgenza precoce e mortalità. Questi risultati forniscono prove solide a sostegno della conclusione dell'IARC secondo cui esistono “prove sufficienti di cancerogenicità [del glifosato] negli animali da laboratorio”. Inoltre, i nostri dati sono coerenti con le prove epidemiologiche sulla cancerogenicità del glifosato e dei GBH.

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(Traduzione parziale)

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